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桥式 ELISA 法检测成人糖尿病患者血清中 ZnT8 抗体

发布时间:2020-01-10 15:07 |  点击次数:

锌转运体 8 是 β 细胞特有的跨膜蛋白,其位于胰岛素分泌颗粒中,参考膜内外锌离子浓度的调节。因此锌转运体 8 也成为了 1 型糖尿病重要的自身抗原。

一、前言

锌转运体 8 自身抗体主要同锌转运体 8 C 端结构域结合,人群基因的多态性使第 325 氨基酸的密码子可表达出三种蛋白质:精氨酸(R)325,色氨酸(W)325,少数情况下表达为谷氨酰胺(Q)325。锌转运体 8 自身抗体可以特异性识别 R325、W325 类,或识别非特异性残基 325,极少数情况下可与Q型结合。RSR公司锌转运体8自身抗体检测试剂盒可定量检测 R325、W325 以及非特异性残基 325 型自身抗体。检测锌转运体 8 抗体可与检测谷氨酸脱羧酶抗体、胰岛细胞抗原 2 抗体等项目形成互补。相比于检测单种抗体,同时检测多项抗体阳性更具诊断价值。

二、材料与方法

1. 材料

血清样本,来源:
1)94 例 1 型糖尿病患者(T1DM);
2)51 例成人隐匿型自免糖尿病患者(LADY);
3)59 例 2 型糖尿病患者(T2DM)包括 28 例初诊断及 31 例不同治疗过程患者;
4)200 名健康志愿者(HBD);
5)30 例格雷夫斯氏病患者;
6)20 例阿狄森氏病患者。



2. 方法

1)桥式 ELISA 法(RSR Ltd)
 

 
2)免疫沉淀分析法(immunoprecipitation assay,IPA):35S 标记 ZnT8 抗原,抗原类型分 W325/R325 二聚体,W325,R325,P325 单体。

3)GADAb ELISA 试剂盒、IA-2Ab ELISA 试剂盒、IAA 放免试剂盒,试剂盒来自 RSR Ltd。


三、研究结果

1. 精密度分析

用两个质控样品(抗体浓度为50 ± 15 u/mL 和 210 ±50 u/mL)进行批间(n=6)和批内精密度(n=10)分析,中浓度 ZnT8Ab 批间和批内精密度分别为 7.1% 和 1.7%,高浓度 ZnT8Ab 批间和批内精密度分别为 8.5% 和 2.7%。

 

2. ZnT8 抗体阳性检测率

用 ELISA 方法,ZnT8Ab 阳性检出率分别为:T1DM 54.3%,LADA 31.4%,T2DM 1.7%。ZnT8Ab ELISA 试剂盒检测 TIDM 及健康人血清样本,通过 ROC 分析,灵敏性为 54%,特异性 99%(cut-off 15 U/ml),AUC 为0.8(95% 置信区间,0.74-0.86)。


 
3. 比较 ELISA 与 IPA 方法检测 ZnT8 抗体

T1DM 患者中,ELISA 为 54.3%(51/94),IPA 为 50%(47/94);LADA 患者中,ELISA 为 31.4%(16/51),IPA 为 29.4%(15/51); T2DM 患者中,ELISA 为 1.7%(1/59),IPA 为 3.4%(2/59);健康对照(HBD)中,特异性分别为 ELISA 99%,IPA 为 96.5%。

4. 线性分析

线性分析中,阳性质控及血清样本用阴性对照品进行了 1:2, 1:5, 1:10, 1:20 的稀释。所有样品,ELISA 检测结果与 IPA(W325/R325 二聚体)检测结果具有很好的一致性(r=0.856, k=0.889, n=204)。在 1 型糖尿病患者和 LADA 患者中的一致性(r=0.837, k=0.875, n=145)(图 4)。

 



5. 用多种不同的抗体检测试剂盒进行分析

T1DM 患者中,对多种抗体检测,阳性率分别为:ZnT8Ab 51/94(54.3%),GAD Ab 70/94 (74.5%),IA-2 Ab 42/94 (44.7%),IAA 24/94 (25.5%)。至少一种方法检测出阳性概率统计为 85.1%,仅 ZnT8 Ab 检测阳性概率为 4.3%,ZnT8Ab 使阳性检出率从 80.9% 上升至 85.1%;

LADA 患者中,GAD Ab 全阳性,ZnT8 Ab 16/51 (31.4%),IA-2 Ab 12/51 (23.5%), IAA 6/51 (11.8%);

28 例新诊断 T2DM 患者中,GAD Ab 检测只有 1 例阳性。在所有 T2DM 患者中(28 例新诊断,31 例不同时期),检出阳性患者数分别为 ZnT8 Ab 1/59 (1.7%),GAD Ab 10/59 (16.9%), IA-2 Ab 2/59 (3.4%),IAA 2/59 (3.4%),至少一种抗体阳性统计结果为 13/59(22%),没有 ZnT8Ab 单独呈阳性检出者。

30 例格雷夫斯氏病患者 ZnT8 Ab ELISA 检测无阳性,20 例阿狄森氏病患者中 ZnT8Ab ELISA 检测 2 例阳性 (23.6 和 48.2 U/mL),对阳性(23.6 U/mL)血清用 GADAb 及 IAA 检测也成阳性,IA-2Ab 呈阴性。另一例 ZnT8 Ab ELISA 检测阳性(48.2 U/mL)因血清不足未能检测。

四、结论

桥式ELISA是一种简单且可重复的检测血清 ZnT8Ab 的方法,可提高成人 1 型糖尿病的抗体阳性检出率。

参考文献:Dunseath G, Ananieva-Jordanova R, Coles R, et al. Bridging-type enzyme-linked immunoassay for zinc transporter 8 autoantibody measurements in adult patients with diabetes mellitus[J]. Clinica Chimica Acta, 2015, 447: 90-95.